三个蛋白之间的关系如何研究?

当研究了两个蛋白之间的相互作用之后，如何进一步研究，毕竟两个蛋白之间的互作并不能说明太多的问题，那么如何将点对点的内容进行拓展，由点到面进行延伸，最终将我们想要解释的信号通路或调控机制解释清楚呢？小远通过看文献给大家整理了一些关于3个蛋白之间的调控关系或互作的方法，可能不一定很全面，毕竟有的内容刚好找到相关的文献案例需要缘分，所以目前就将已经收集的方法分享给大家，希望对大家的实验有所帮助噢！

1酵母三杂交（pBridge系统）验证3个蛋白关系

在“Cryptochrome 2 competes with COP1 substrates to repress COP1 ubiquitin ligase activity during Arabidopsis photomorphogenesis”一文中，作者为了研究COP1、CRY2以及PAP2三者之间的关系，用了好几种方法进行验证，这里挑选酵母三杂交（Y3H）与基于荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像技术（FRET-FLIM）的共定位实验进行讲解。为了帮助大家更好地理解，小远会对里面的一些背景知识进行介绍。

1.1背景知识

1.1.1名词解释

COP1：COP1是光形态建成的核心抑制子，它是一个含有RING结构域的E3泛素连接酶，可以直接泛素化下游光形态建成促进因子，并促使它们通过26S蛋白酶体降解，以此来抑制植物的光形态建成。C端的WD40重复结构域可用于底物识别，与光感受器相互作用。

CRY2：拟南芥隐花色素蛋白，隐花色素是指能够感受蓝光和近紫外光（330-390nm）区域的光的一种受体。可以与COP1/SPA复合物发生蓝光依赖的相互作用。

PAP2：花青素合成调节蛋白，是一个R2R3 MYB转录因子，可以调节花青素生物合成对光的响应。另外，PAP2可以被COP1/SPA复合物靶向调控。

VP motif：VP基序由一系列残基组成：VP（E/D）ɸG，其中ɸ代表一个疏水氨基酸。CRYs在其CCT结构域中携带VP基序，表明这可能是COP1-WD相互作用蛋白的普遍特征。

1.1.2研究背景

在植物中，隐花色素光感受器（例如CRY1、CRY2）抑制COP1/SPA泛素连接酶的活性，在蓝光下启动光形态建成。CRY1和CRY2都以蓝光依赖的方式与COP1/SPA复合物相互作用。目前，通过与光激活的CRYs直接相互作用抑制COP1活性的机制尚不完全清楚。因此，作者做了CRY2通过取代COP1的降解底物（本文中是PAP2）来抑制COP1的假设。后面围绕这个进行了研究，在前面的结果中，作者证明了CRY2与PAP2两个蛋白都可以利用自身的VP基序与COP1发生互作。CRY2与PAP2蛋白是否互作作者并没有进行研究，这应该不是作者研究的方向。

有了上面的背景知识做铺垫，现在再来看文中的描述，很多东西就比较好理解了。下面仅挑选文中研究3个蛋白互作关系的内容给大家进行介绍。

酵母三杂交研究3个蛋白互作实验结果

作者为了研究CRY2和PAP2竞争COP1-WD40结构域的可能性，分别将COP1与CRY2、CRY2-VPAA构建至pBridge载体上，将PAP2构建至AD载体上进行酵母三杂交（Y3H）实验，比较了CRY2存在或不存在时COP1与PAP2之间的相互作用强度（图1）。CRY2作为“桥”蛋白表达后，COP1和PAP2之间的相互作用明显减少，并且在蓝光下的作用比在黑暗中更强（图1）。事实上，在蓝光下，在共表达CRY2的条件下，没有观察到COP1和PAP2之间的相互作用。这表明CRY2可以在酵母中以蓝光增强的方式破坏COP1-PAP2的相互作用。值得注意的是，COP1和PAP2之间的相互作用不受CRY2-VPAA共表达的影响（图1）。这一结果与CRY2利用其VP基序与COP1相互作用，从而破坏COP1与PAP2之间的联系的想法是一致的。

图1 酵母三杂交实验验证CRY2与PAP2竞争与COP1的相互作用(Ponnu et al., 2019)。以COP1为诱饵，PAP2为猎物，在CRY2或CRY2-VPAA存在或不存在的情况下进行Y3H实验。在共转化的酵母细胞在黑暗中培养4天，然后在蓝光（50μmol m-2 s-1）下培养4小时后，测定β-半乳糖苷酶活性。星号表示在蓝光下，CRY2存在与CRY2不存在COP1与PAP2的相互作用有显著差异（**P<0.01）。

酵母三杂交（pBridge系统）技术补充小知识：

不知道大家看了上面的那段话之后能不能完全理解，虽然小远已经尽可能写的更明白了，不过不懂也没关系，这不，更详细的解释不就来了嘛！这里讲到的酵母三杂交是在酵母双杂交的技术上改进而来的，用于研究3个蛋白之间的互作，在之前的推文“酵母杂交那些事儿（一）”中给大家简单介绍过，与这篇文章中用到的方法有些差别，因此，这里结合Clontech公司酵母三杂交的说明书（文中用到的是他们家的试剂盒）给大家再详细说明一下。

这里的酵母三杂交系统引进了一个pBridge质粒（图2），该质粒和任何来自Clontech公司基于Gal4的双杂交系统的AD融合载体结合使用时（图3），pBridge可以建立三杂交系统。pBridge质粒能够同时插入两个外源蛋白，两个外源蛋白分别插在载体的MCSI与MCSII位点。在MCSI插入的蛋白的N端仍然融合Gal4系统中的BD结合域氨基酸多肽片段，而在MCSII中插入的蛋白不融合任何标签，但是在其上游有一个Pmet25启动子，这个启动子的特点是只有在甲硫氨酸（Met）缺乏的时候才能工作，使下游蛋白基因表达，所以必须要在甲硫氨酸缺陷型培养基中进行实验。

将第三个蛋白基因克隆到pGADT7裁体上，然后分别将构建好的pBridge质粒与pGADT7质粒共转酵母菌株进行验证，后续的操作与酵母双杂基本一致，这里就不再多讲，需要注意的一点是所有的缺陷型培养基都必须是甲硫氨酸缺陷型的基础上配置的。

图2 pBridge载体信息（Clontech公司）。

图3 Gal4系统酵母双杂载体，左图为BD载体，右图为AD载体，酵母三杂交就是利用pBridge载体替换了这里的BD载体（Clontech公司）。

相信大家看完酵母三杂交技术的详细介绍之后，再回去看上面那个结果应该就比较好理解了。其实这个技术有好几个方面的应用，具体的大家可以去查看Clontech公司该试剂盒的说明书，这里就不再给大家详细讲解了，因为列举这个例子已经讲了很多的背景知识啦！

2 基于FRET-FLIM的共定位实验研究3个蛋白之间的关系

这个实验是紧接着上面酵母三杂交实验进行的，只不过是用另外一种方法验证同一个结果而已。小远之前也给大家讲过，要得出一个结论一般都需要用好几种方法进行验证，接下来我们就一起去看看下面这个方法吧！

为了验证植物中的竞争假说，作者设计了一种基于荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像技术（FRET-FLIM）的共定位实验，用3个独立的载体同时轰击韭菜细胞，表达分别融合在3个不同荧光标签YFP、mCherry和CFP上的COP1、PAP2、CRY2或CRY2-VPAA的蛋白。将CFP标签融合在CRY2和CRY2-VPAA上的目的是通过在显微镜下观察CFP信号，确认每个CFP标记蛋白在每个细胞中成功表达。结果观察到，YFP-COP1能够招募mCherry-PAP2在共表达的韭菜细胞中共定位于核体（NBs）。CFP与YFP-COP1和mCherry-PAP2共表达并不影响mCherry-PAP2与YFP-COP1的共定位（图4）。相反，共表达CFP-CRY2破坏了大多数韭菜细胞中共定位的COP1-PAP2 NBs的形成（图4）。YFP-COP1将CFP-CRY2招募到这些细胞中的NBs中。相比之下，CFP-CRY2-VPAA的共表达并没有改变mCherry-PAP2和YFP-COP1的共定位（图4）。这说明CFP-CRY2-VPAA不能影响YFP-COP1向NBs中招募mCherry-PAP2。综上所述，这些共定位分析表明，CRY2的VP基序与PAP2竞争与COP1的结合，从而阻止了COP1介导的PAP2被招募到NBs中。

图4 基于FRET-FLIM的共定位实验验证CRY2与PAP2竞争与COP1的相互作用(Ponnu et al., 2019)。其图为韭菜细胞的代表性共聚焦图像。所指示的通道随后被合并以显示共定位。（比例尺：10μm）。

3 酵母三杂交（3个载体系统）验证3个蛋白关系

这里小远还给大家找了另一种酵母三杂交的文献案例，这里用到的方法与小远之前在“酵母杂交那些事儿（一）”的图6中提到的方法是一样的，具体的做法与酵母双杂稍有不同，首先分别构建AD、BD两个载体，然后再构建第三个载体，这个载体只要将需要研究的第三个蛋白过表达出来就可以了，将这3个载体构建好之后共转酵母菌株进行研究，下面我们就一起去看看具体的案例吧！

在“Uncovering a novel function of the CCR4-NOT complex in phytochrome A-mediated light signalling in plants”一文中，NOT1和phyA都通过PNB位点与NOT9B相互作用（图5A），作者为了验证两个蛋白（NOT1、phyA）是否竞争与NOT9B的结合，作者使用了酵母三杂交的实验方法来进行验证。在表达AD-NOT9B和phyA-BD的酵母细胞中，共表达NOT1 M，NOT1 MIF4G-GFP或NOT1 DUF。NOT1 M或NOT1 DUF的共表达强烈地降低了NOT9B和phyA相互作用在选择培养基上的生长，而缺乏NOT9B结合位点的NOT1 MIF4G-GFP则没有影响（图5B）。到这里作者并没有结束，而是做了更加细致的实验。

图5 酵母三杂交实验验证NOT1和phyA竞争结合NOT9B(Schwenk et al., 2021)。（A）NOT1和NOT9B的结构域和相互作用域。（B）酵母三杂交竞争试验。将酵母双杂交对AD-NOT9B和phyA-BD编码的质粒转化AH109细胞，并将不同的NOT1片段作为潜在的竞争对手。酵母细胞在R光下生长在CSM LTH-板上，添加20mm藻蓝糖苷，并增加了3-AT的含量。采用CSM LT板作为转化对照。

首先作者进一步证明了NOT1与phyA竞争NOT9B的结合确实是因为NOT1与phyA都存在NOT9B的结合位点，而不是NOT1与phyA之间存在什么关系导致的。因此，作者用NOT1去干扰FHY1与phyA的结合，结果发现没有一个NOT1片段与FHY1竞争phyA的结合，这表明NOT1和phyA的共表达通常不会干扰phyA与其结合蛋白的相互作用（原文献图6-图补充1A）。

为了证实AD-NOT9B和phyA-BD的表达不会因NOT1片段的共表达而降低，作者使用HA标记的AD-NOT9B和NOT1 M，以及LUC标记的phyA-BD进行Y3H竞争分析。HA-NOT1 M的共同表达明显降低了表达Y2H对HA-AD-NOT9B/phyA-LUC-BD的细胞的生长，但对HA-AD-NOT9B和phyA-LUC-BD蛋白水平的影响很小（原文献图6-图补充1B，C）。

补充说明：这里标注的原文献补充图小远原本想找给大家，但是无奈补充图的链接尝试过多次都打不开，因此这里将原文的链接（

https://elifesciences.org/articles/63697#data）提供给大家，大家有兴趣可以自己去看看补充图，也许补充图只为有缘人打开噢！给大家带来不好的体验真是非常抱歉！

同样地作者利用酵母三杂交实验证明了NOT1与phyA竞争NOT9B的结合之后，也用了荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像技术（FRET-FLIM）的共定位实验进行验证，其结果如下：

在瞬时表达NLS-YFP-NOT9B和phyA-NLS-CFP的烟草叶片中，结合NOT9B受损的NOT1片段（FLAG-myc-mCherry-NLS-NOT1 MIF4G-mCherry）对NOT9B到核体的募集没有影响（图6）。相比之下，FLAG-myc-mCherry-NLS-NOT1 M的共表达（包括NOT1的NOT9B结合位点），几乎完全消除了NOT9B向核体的募集，但不影响phyA核体的形成。这一发现与植物中phyA和NOT1竞争结合NOT9B的结论是一致的。

图6 NOT9B核体形成的定量研究(Schwenk et al., 2021)。将质粒按照p35S:NLS-YFP-NOT9B（YFP-NOT9B），p35S:PHYA-NLS-CFP（phyA-CFP）或p35S:CFP（CFP），

p35S:FLAG-myc-mCherry-NLS-NOT1 M（mCherry-NOT1 M）或-NOT1 MIF4G-mcherry（mCherry-NOT1 G）的组合利用农杆菌侵染4周龄的烟草叶片。将植物在黑暗中保存2天，然后在荧光显微镜下观察。左边是有代表性的图片。比例尺代表5μm。每个质粒组合随机选择25个核，进行核体形成评估。柱状表示三个生物重复的平均值（±SD），并显示各自通道中核体与核的相对数量。

其实小远除了找到上面举例提到的两个酵母三杂交的方法之外，还找到了另外一种酵母三杂交的文献，不过那篇文献是介绍具体方法的，并不像这里的是应用案例，因此小远在这里将那篇文献的题目告诉大家，大家要是感兴趣的话可以自己去下载查看，这里就不再展开讲解了。文献题目：Tri-SUS: a yeast split-ubiquitin assay to examine protein interactions governed by a third binding partner。

小远叨叨

本篇文章其实比较简单，就是给大家介绍了两种酵母三杂交的方法，以及荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像技术（FRET-FLIM）的共定位实验，这里提到的方法基本都是研究两个蛋白竞争结合第三个蛋白的案例。大家都熟悉研究两个蛋白互作的方法，比如想要研究两个蛋白之间的直接互作，大家就会想到用Pull-down或者酵母双杂的方法。对于3个蛋白之间的研究方法是不是也能把有些方法烂熟于心呢？小远并不清楚，只是希望大家今天看完这篇文章之后，以后想要研究两个蛋白竞争结合第三个蛋白的时候，也能想到小远今天给大家介绍的酵母三杂交的方法以及荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像技术（FRET-FLIM）的共定位实验。

由于篇幅的原因还有一些方法小远还没来得及展示，那就敬请期待第二篇吧！后面小远会给大家介绍利用Co-IP、Pull-down等方法研究3个蛋白之间互作的文献案例，喜欢的话记得持续关注伯小远噢！

References：

Ponnu J, Riedel T, Penner E, et al. Cryptochrome 2 competes with COP1 substrates to repress COP1 ubiquitin ligase activity during Arabidopsis photomorphogenesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2019, 116(52): 27133-27141.

Schwenk P, Sheerin D J, Ponnu J, et al. Uncovering a novel function of the CCR4-NOT complex in phytochrome A-mediated light signalling in plants[J]. Elife, 2021, 10: e63697.

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