10.5
知识分子
The Intellectual
导 读
2022年诺贝尔化学奖授予美国化学家凯罗琳·贝尔托西，丹麦化学家莫滕·梅尔达和美国化学家卡尔·巴里·沙普利斯，表彰他们对“发展点击化学和生物正交化学”做出的贡献。其中，沙普利斯是第二次获得诺奖。
历史上获得两次诺奖的科学家只有4位，居里夫人（物理奖、化学奖）、巴丁（物理奖、物理奖）、鲍林（化学奖、和平奖）、桑戈（化学奖、化学奖）。今天美国科学家Sharpless成为第五位获得两次诺奖的科学家。他上次获奖是2001年，今天第二次获奖。他的姓Sharpless可以开玩笑曲解为“不聪明”。请允许我们小小幽默一下。
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根据诺奖官网介绍，Barry Sharpless 和 Morten Meldal 的工作为化学的功能形式——点击化学——奠定了基础，使得分子结构单元快速有效地结合在一起。而Carolyn Bertozzi 将点击化学提升到了一个新的维度，并开始在生物体中使用它。
Carolyn Bertozzi的学生、北京大学化学学院院长陈兴，告诉《知识分子》：生物正交和点击化学分别从生物标记和有机合成的特异、高效出发，殊途同归，成为了在化学、生命和材料科学个领域应用最广泛的化学反应。获得2022年的诺贝尔化学奖，体现了有机化学的强大以及学科交叉的魅力。
陈兴昨天给Carolyn（注：今天获奖的女科学家）发短信，还在开玩笑她今年是否要得奖。刚刚发去祝贺短信，她回了个“意外惊恐”的表情。
迅速崛起的热点：新型点击化学技术凸显巨大应用前景
撰文 | 李研
责编 | 陈晓雪
2014年，诺贝尔化学奖得主Karl Barry Sharpless的研究团队在《德国应用化学》（Angew. Chem. Int. Ed. ）上报道了一种基于六价硫氟交换（SuFEx）的点击化学反应[1] (图1)。这是一篇形式非常独特的论文。文章报道了有关磺酰氟系列反应的原创研究成果，但却是以综述（review）的形式发表，而且是一篇带有几百页补充材料的综述。这种前无古人的独特报道方式能够发表，凸显了作者和期刊编辑对这一研究成果的高度重视。
►图 1 . 图片来源：Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 9430
六价硫氟交换反应很有趣也很有用，但要充分理解该反应的意义，我们还需要先对“点击化学”这个宏大概念先做一点了解。
点击化学概念的提出
点击化学（Click Chemistry），有时也被译为链接化学，是Sharpless 教授最先提出的一种合成理念[2]。
回顾点击化学理念提出之前的有机合成发展，二战后美国主导了该领域的前沿，研究工作侧重于通过碳碳键（C-C）的构建合成复杂的分子结构（特别是天然产物），涌现出以R. B. Woodward和E. J. Corey 等为代表的全合成大师。他们的工作体现了人们挑战自然的勇气，报道的一些新颖合成方法也让有机化学的内容更加丰富和系统化，但这些反应常因为操作难度高或产率较低，而不易被其他领域的研究者广泛应用。
核酸和蛋白质是自然界中常见的生物大分子，复杂的化学结构和丰富的生物功能由小分子单元借助碳-杂原子键（磷酸酯键和肽键）的链接而实现。受此启发，Sharpless 在2001年提出点击化学理念，强调以碳杂原子键（C-X-C）甚至无机连接的合成为基础，快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。
点击化学理念的倡导者认为，在化学和其它学科（材料，生物）的交叉领域，化学合成能处于核心地位，其本质是作为一门工具，而工具的复杂程度往往与它的应用性成反比，追求过分专业和高度复杂的工具是舍本逐末。分子的形式（Form）与分子的功能（Function）直接相关，但更重要的是实现功能[3]。
正所谓“良剑期乎断，不期乎镆铘；良马期乎千里，不期乎骥骜”，点击化学的核心思想似乎与中国古代朴素实用的哲学思想颇有一些相通之处。
点击化学反应的第一个经典之作
紧随点击化学概念的提出，一价铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应（CuAAC 反应）在2002年被Sharpless 和Medal组分别独立报道[4,5]。该反应可谓点击化学中的第一个经典之作。
叠氮和端炔在绝大多数化学条件下保持稳定，却可以在一价铜催化条件下，高效专一地转换为1，3-取代的三氮唑(图2)。与其结构完全一致的链接基团在自然界中尚未被发现，但条件温和、产率高、具有很高的化学选择性且不受水氧干扰等特点成为该反应的突出优势。虽然点击化学的意义并不仅仅在于降低操作难度，但相对简单的操作确实为这种技术的广泛使用创造了条件。如果用摄影技术来类比有机合成，那么天然产物全合成中用到的一些高难方法犹如需要反复摸索才能掌握的单反相机，让凡夫俗子只有欣赏的份儿，但点击化学好像便捷的手机拍照，使更多人可以轻松上手。
►图2
六价硫氟交换反应的原理
CuAAC反应取得了巨大的成功，但是这个反应在应用上也有弱点：必须将叠氮基团引入有机化合物，这就导致反应放大时可能带来安全隐患；环加成反应生成的三氮唑堪称一个完美的链接方式，但此类化合物具有较大的极性和较低的溶解度，这些都在一定程度上限制了该反应在合成聚合物的材料领域和药物合成领域的应用。
基于CuAAC的成功经验和点击化学理念的进一步发展，Sharpless 课题组自2014年起集中报道了六价硫元素氟化物的合成及其独特反应性的一系列工作。和CuAAC反应类似，我们需要寻找一种基本化学条件下稳定存在，但在特殊情况下又超级活泼的官能团。
在高价硫化合物中，芳基磺酰氯（例如Ts-Cl）是有机化学家常用的亲电试剂。磺酰氯(-SO2Cl)活性很高，对湿气敏感，故在应用范围上有一定的局限性。幸运的是，高价硫氟化物在具有反应活性的同时，又在绝大多数化学条件下可以保持稳定，正是点击化学需要的官能团。高价硫氟化物最初的反应活性研究可以追溯到多年之前 ，但当时并没有引起相关的重视，而Sharpless教授团队意识到这类化合物的重要性，并在先前的基础上进一步发扬光大，开启了SuFEx 反应的探索历程(图3)。
►图 3. 图片来源：Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 9466（其中图中的Ref. 9 为 V. Gembus, F. Marsais, V. Levacher, Synlett 2008：1463, 是较早研究磺酰氟基团反应活性的文献之一。）
SuFEx反应最初的报道中，用到一种已经商业化生产的气体：磺酰氟（SO2F2）。这是一种熏蒸剂，在美国常用作消除房子内白蚁等害虫，却丝毫不影响墙体和屋内陈设。SO2F2在通常条件下十分稳定，但在特定情况，如一些有机碱的存在条件下，S-F键可以被活化，与羟基或者硅醚反应转变为S-O键，形成芳基氧磺酰氟（Ar-O-SO2F）。特别值得一提的是，SO2F2与酚羟基的反应活性明显优于醇羟基和氨基。而Ar-O-SO2F还可以进一步与羟基或者硅醚反应，形成的Ar-O-SO2-链接具有良好的稳定性，对水气的敏感性远低于磷酸酯等类似物（图4）。
►图4. 图片来源：Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 9430
SO2F2气体可以与咪唑基团结合成盐，并作为一种稳定的磺酰氟基团给体。这解决了SO2F2气体操作不便的问题，结合后的磺酰氟基团反应活性也会大幅度提升，可以直接与一级胺（-NH2）发生反应[6]（图5）。该研究工作于2017年末被Angew. Chem. Int. Ed. 接收。在这篇论文中，Sharpless教授首次使用了上海有机所作为自己的唯一通讯单位[7]。
►图5. 图片来源：Angew. Chem. Int. Ed. DOI: 10.1002/anie.201711964, ASAP
除了SO2F2气体，最近另一种六价硫气体SOF4也进入了Sharpless课题组的研究视野[8]。SOF4对胺基官能团的反应活性高于羟基，从而得到另一种形式的六价硫链接。结合SO2F2气体对酚羟基的高度选择性，可以实现对化合物的正交修饰（图6）。
►图6. 图片来源：Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 2903
鉴于SuFEx反应的重要性，生化试剂生产商和供应商Sigma-Aldrich已经专门设立网页，对常用的原料化合物库进行销售[9]。
SuFEx 反应的初步应用
Sharpless 团队及其他研究小组在多篇论文中讨论了这种可控性的链接反应在聚合物、小分子和生物分子的应用。
例如，中国科学院上海有机化学研究所研究员董佳家与Scripps研究所和苏州大学的团队合作，发现一类阴离子氟盐[HF2]-可以作为高效的催化剂进一步促进SuFEx反应，合成聚硫酸酯或聚磺酸酯类高分子材料（图7）[10]。与聚碳酸酯和聚酯类材料相比，相应的聚硫酸酯和聚磺酸酯类材料具有更高的化学稳定性和优异的力学性能。
►图7. 图片来源：
https://cen.acs.org/articles/95/i26/New-catalytic-route-polysulfates-polysulfonates.html.
苏州大学路建美团队与Scripps所吴鹏课题组合作，通过SuFEx反应制备具有反应活性的聚合物[11]，并可通过进一步修饰偶氮苯调节表面亲疏水性(图8)。-SO2F基团的存在不影响聚合反应的发生，同时克服了传统聚合物表面修饰活性不够和反应不够精准的问题。
►图8. 图片来源： Chem. Eur. J. 2017, 23, 14712
佐治亚大学化学系的Jason Locklin等近期发表的相关综述，总结了SuFEx 在新材料合成和表面修饰等领域的应用进展[12]。
在合成方法学方面，上海有机所姜标小组应用氟磺酰氧基(ArOSO2F)作为三氟甲磺酰基 (ArOTf) 的廉价替代官能团[13]，在水相实现了高产率的Suzuki偶联反应（图9）。
►图9． 图片来源：Org. Lett. 2015, 17, 1942
“聚合物和SuFEx反应性是意外的发现，最有趣的应用可能还不是材料领域”，董佳家表示, “有趣的应用在于携带该类官能团的小分子、大分子会在活体内直接、极高选择性的，又同时被分子本身结构决定的和有相互作用的蛋白质直接反应。”
例如，借助SuFEx独特的反应性可能实现复杂体系下小分子与大量功能不相关蛋白质高选择性的链接。董佳家和Chen Wentao等报道了在生理条件下氟磺酰氧基可以选择性标记蛋白大家族中的脂结合蛋白 [14]。这种高度的化学选择性缘于脂结合蛋白中酪氨酸位点受附近的精氨酸侧链影响，酚羟基的亲核性显著提高，从而有助于与芳基磺酰氟的顺利链接（图10）。
►图10. 图片来源：J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 7353
SuFEx这种特殊的选择性不仅可用于标记蛋白，更对药物筛选具有重要意义。最近，Scripps 研究所的一篇论文探讨了氟磺酰氧基在“反药物合成”（Inverse Drug Discovery）方法学中的应用[15]，由该所化学、化学生物学、结构生物学和药物化学的团队共同完成。传统药物筛选通常需要检测某种蛋白与海量小分子之间的相互作用，在蛋白的分离和提取过程中耗时繁多，而反药物合成法则是反其道而行之，期望从细胞或蛋白组中直接挑选出与小分子具有结合能力的蛋白，而氟磺酰氧基便是一个理想的具有高度选择性的亲电官能团。
Sharpless 和董佳家用一种称为“边缘的酸碱反应性（Fringe Acid Base Reactivity）”的理论解释SuFEx这种近乎逆天的选择性，并认为这是一种具有探索意义的广义点击化学理念[1]。而相比于先前的CuAAC一代点击化学反应，董佳家强调：“虽然设计原则和CuAAC反应一致，但是一代点击反应是A官能团绝大多数条件稳定，遇到催化条件和官能团B会正交高效链接。而SuFEx最强大的一点是只有A官能团，B不确定，由系统决定。第一代反应是A+B最高的反应性代表，第二代点击化学SuFEx是如何实现A+系统。” 换句话说，“CuAAC是研究工具，而SuFEx更像是一个发现工具。”
展 望
以CuAAC为代表的点击化学领域从创立到今天只经历了短短15年，该技术就已经受到几乎所有化学相关学科的高度重视。《德国应用化学》前主编Peter Gorlitz在前不久接受美国化学学会旗下期刊C&EN采访时，将Sharpless 2001年发表的第一篇点击化学论文视为他最喜欢的一篇文章[16]，而这篇点击化学奠基工作的被引用量也已经近万次，远超过为Sharpless赢得诺奖的不对称环氧化相关报道。
作为新型点击化学技术，SuFEx反应虽然刚刚兴起不久，但高价硫氟类化合物也已经材料化学、化学生物学、生物制药等领域上展现出巨大的应用前景，预示着该领域将迅速崛起并成为点击化学以及氟化学热点之一。
参考文献
[1] J. Dong, L. Krasnova, M. G. Finn, K. B. Sharpless, Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 9430
[2] H. C. Kolb, M. G. Finn, K. B. Sharpless, Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004.
[3] M. G. Finn, Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 1231.
[4] V. V. Rostovtsev, L. G. Green, V. V. Fokin, K. B. Sharpless, Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596.
[5] C.W. Tornøe, C. Christensen, M. Meldal, J. Org. Chem. 2002, 67, 3057.
[6] T. Guo, G. Meng, X. Zhan, Q. Yang, T. Ma, L. Xu, K. B. Sharpless, J. Dong Angew. Chem. Int. Ed., DOI: 10.1002/anie.201711964, ASAP
[7] Sharpless教授与2016年5月被聘为上海有机所的特聘教授。
[8] S. Li, P. Wu, J. E. Moses, K. B. Sharpless, Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 2903.
[9] http://www.sigmaaldrich.com/chemistry/chemistry-products.html?TablePage=111296651
[10] B. Gao, L. Zhang, Q. Zheng, F. Zhou, L. M. Klivansky, J. Lu, Y. Liu, J. Dong, P. Wu, K. B. Sharpless, Nature Chemistry 2017, 9, 1083.
[11] H. Zhu, D. Chen, N. Li, Q. Xu, H. Li, J. He, H. Wang, P. Wu, J. Lu, Chem. Eur. J. 2017, 23, 14712.
[12] J. Yatvin, K. Brooks, J. Locklin, Chem. Eur. J. 2016, 22, 16348.
[13] Q. Liang, P. Xing, Z. Huang, J. Dong, K. B. Sharpless, X. Li, B. Jiang, Org. Lett. 2015, 17, 1942.
[14] W．Chen, J. Dong, L. Plate, D. E. Mortenson,G. J. Brighty, S. Li, Y. Liu, A. Galmozzi, P. S. Lee, J. J. Hulce, B. F. Cravatt, E. Saez, E. T. Powers, Ian A. Wilson, K. Barry Sharpless, J. W. Kelly, J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 7353.
[15] D. E. Mortenson, G. J. Brighty, Lars Plate, Grant Bare, Wentao Chen, Suhua Li, Hua Wang, Benjamin F. Cravatt, Stefano Forli, Evan T. Powers, K. Barry Sharpless, Ian A. Wilson, and Jeffery W. Kelly J. Am. Chem. Soc., DOI: 10.1021/jacs.7b08366, ASAP
[16]https://cen.acs.org/articles/95/i48/German-journal-became-top-tier.html?utm_content=buffer6fad9&utm_medium=social&utm_source=linkedin.com&utm_campaign=buffer
卡罗琳·贝尔托西小传：自己指导自己的化学奇才
卡罗琳·贝尔托西
卡罗琳·贝尔托西（Carolyn R. Bertozzi）是斯坦福大学化学教授、化学与系统生物学和放射学教授，霍华德·休斯医学研究所研究员，美国科学院院士，美国医学研究所成员，美国文理科学院成员。她1988年本科毕业于哈佛大学，1993年获得加州大学伯克利分校的化学博士学位。值得一提的是，在其研究生最后的两三年，由于导师患病，贝尔托西实际上是自己指导的自己的博士研究。1996年，她在加州大学伯克利分校建立了自己的课题组，开始独立研究，并在1999年获得麦克阿瑟天才奖，2022年获得沃尔夫化学奖。
2015年，她的课题组搬到了斯坦福大学。贝尔托西的研究兴趣广泛，涉及了化学和生物学等各个方面，但目前的研究重心在细胞表面在病变时的糖基化上，包括在癌症、发炎和感染时产生的不同糖基化反应，以通过研究辅助疾病的诊断、预防和治疗。
卡罗琳·贝尔托西获得此次诺贝尔化学奖，与她在糖类分子中的贡献密切相关。有趣的是，卡罗琳能够进入哈佛大学，主要是因为她足球踢的好。不过，这位女士发现化学才是自己的真爱，并在化学界权威对女生不太看好和导师生病的情况下，自己指导自己在化学界崭露头角。
撰文 | 谭忠平 李耀豪
足球踢得好，被哈佛录取
卡罗琳1966年出生于美国东北部马萨诸塞州的列克星敦（Lexington）。她的祖父母是在墨索里尼政府时代从意大利逃到到美国去的，外祖父母则是在30年代经济大萧条的时候代从加拿大移民到美国的。
她父母的相遇相知比较符合传统套路，当时她父亲是麻省理工学院物理系的教授，母亲是系里的秘书，就这样自然而然地认识了。她的父母据说也比较传统，比如自己建造房子，想生个男孩，信奉必须有一技之长养家糊口的信条，希望子承父业等。
当然他们也没能完全如愿，只生了三个女儿，三个女儿也不想如他们所愿进入麻省理工学院学习物理。大姐安德莉娅·贝尔托西（Andrea Bertozzi）选择了去普林斯顿大学读博士，后来成为了杜克大学（Duke）的数学教授，现在是加州洛杉矶大学（UCLA）的教授。作为老二的卡罗琳则选择了麻省理工学院的邻居哈佛大学，最小的妹妹更加叛逆，直接选择了在学业上放飞了一段自我。
哈佛大学录取卡罗琳的原因之一是她足球踢得好，另外她在音乐上也颇有造诣。不过她最后还是听了父母的话，选了一个能够以后养家糊口的生物专业。而当时选择这个专业的原因也很简单，高中有个生物老师讲课讲得好，让她觉得生物非常有趣。不过在本科二年级学习了有机化学后，她还是发现有机化学才是她的最爱，于是化学成为了她本科的专业。
进入哈佛大学后，卡罗琳就开始了她尤如神助的科学生涯。从1987年到现在，她已经获得了大约60个知名的奖学金、奖励或荣誉称号。如果一定要说有挫折的话，她也只是有两个有意思的小挫折。其中一个来自于哈佛大学。卡罗琳读本科的时候，正是有机全合成在美国发展的鼎盛时期，而哈佛大学化学系的有机合成又是全球的执牛耳者。卡罗琳很想加入哈佛的有机合成实验室做本科研究，但是让她非常沮丧的是，那些有机合成的权威们不招女生。
正好有个做物理有机化学的助理教授约瑟夫·格拉博夫斯基（Joseph Grabowski），因为严重缺少人手，就邀请卡罗琳加入他的实验室做本科毕业论文。也算因祸得福，由于导师有足够多的时间细心指导，她的论文意想不到地获得了 Thomas T. Hoopes 本科论文奖。
在研究生期间，卡罗琳还是想做有机合成，于是选择了去美国西部大湾区不那么保守的加州大学伯克分校学习。在这里，她不但接触到了有机合成，还第一次接触到糖，接触到了日后她的科研中的几乎所有关键的元素，象重叠基团（Azide），连接分子（Linker），和化学糖生物学。这些元素主要来源于她的导师马克·贝德纳尔斯基（Mark D. Bednarski），而她导师研究思想的形成可能又与自身经历相关：他的博士学位是在糖合成大师塞缪尔·丹尼舍夫斯基（Samuel J. Danishefsky）的耶鲁大学实验室获得的，而博士后则是在哈佛大学的乔治·怀特塞兹（George M. Whitesides）实验室从事的酶催化化学反应研究。卡罗琳加入他实验室的时候，他刚刚独立开展研究工作一年。
卡罗琳在伯克利主要是通过合成，将单糖以非天然碳原子连接的方式做成探针或配体分子，研究它们对微生物的抑制作用。在研究碳连接单糖分子的同时，她也遇到了第二次小挫折。在研究生三年级的时候，她的导师先是由于结肠癌的治疗，在整个一年里无法给予实验室正常的指导。在卡罗琳研究生第四年的时侯，导师选择离开了伯克利到斯坦福学医学院开始攻读他自己的医学博士学位。
当然这个小挫折并没有给卡罗琳造成很大的障碍，她开始自我指导做研究、写文章、申请基金，一口气在研究生四年级发表了六篇第一作者的文章，然后顺利地在1993年毕业，顺利地申请到了美国癌症协会的博士后奖学金，并从化学方向转到生物方向，跟随加州大学旧金山分校的史蒂文·罗森（Steven D. Rosen）教授探索确定L-选择素底物的结构特征。通过与劳拉·基斯林（Laura L. Kiessling）教授的合作，她们发现，与L-选择素特异结合的糖是一个常见的结构，它的特殊性在于糖的6位羟基上带有硫酸基团。
化学糖生物学的提出和推进
博士后刚刚做了一年半，卡罗琳就在朋友的建议下申请了斯坦福、伯克利和旧金山分校的助理教授，并顺利被三个名校录取，最后她选择在1996加入研究生母校伯克利。
卡罗琳在伯克利的学术之路也是异常顺利，1999年就成了副教授，2002年成了教授。在这短短的六年里，她获得了大多数人一辈子都无法获得的学术奖励：六年中一共获得23个奖，其中包括1999年获得的麦克阿瑟 “天才奖”（McArthur Foundation Award）。她获得该奖时只有33岁，是当时最年轻的获奖者。她还在2000年成为所有科学家梦寐以求的霍华·德休斯医学研究所研究员称号（HHMl）并将其一直保持至今。这一称号意味着每年大量的科研经费支持。在一年之后的2003年，她成为了美国艺术与科学学院院士（AAAS），2005年，成为了美国国家科学院院士（NAS）。
这些奖励的获得，主要是由于卡罗琳在细胞表面的糖修饰方面快速取得的突出成绩。在独立开展工作后仅仅一年，她就利用她在细胞生物学和化学两方面的知识，在《科学》（Science）上发表了一篇创新性的文章。在这篇文章中，她使用非天然单糖诱使细胞在其表面表达的糖中引入含有羰基的唾液酸，羰基与肼等基团之间的高效反应使细胞表面糖分子的选择性修饰成为可能。这种修饰技术，除了可以更好地实现糖分子的成像、标记以及质谱定量与糖组学分析外，还为研究和开发针对感染、炎症和癌症等疾病的治疗方法提供了可用的工具。
在文章发表后的十多年里，卡罗琳研究的重点都是围绕着这个研究成果展开的。在2003年，她发明了一个新术语，生物正交化学 （Bioorthogonal chemistry），用来描述她使用的这一类研究方法。生物正交化学，简单的说就是在生物体内复杂的环境下，能让外源分子或官能团快速高效地发生反应，同时又不影响生物体内分子间正常反应的化学。它是让卡罗琳迅速成名的一项最重要的研究，也是使她每年都成为诺贝尔奖预言榜上大热门的工作之一。
虽然羰基是卡罗琳最先在生物正交化学中使用的官能团，但是这个官能团却有一个很大的缺陷，那就是在很多代谢产物上带有的羰基会对研究形成很大的干扰。如果说卡罗琳在科研中最喜欢什么的话，叠氮基团应该是其中排名非常靠前的一个。从研究生时期她就开始频繁使用叠氮基团。这就不难理解她为什么很快把生物正交化学的注意力转移到了叠氮基团上。
卡罗琳最早开发的基于叠氮官能团的生物正交反应是2000年使用的施陶丁格偶联反应（Staudinger ligation）。这个偶联反应是通过叠氮化物与特殊设计的三芳基膦形成酰胺键实现的。反应具有很高的选择性，但是膦分子容易被氧化，同时反应速度又相对较慢，这些不足影响了此反应更好的应用。
在2001年诺贝尔奖获得者巴里·夏普莱斯（K. Barry Sharpless）报道了由铜离子催化的叠氮基团和末端炔基之间发生的点击化学反应（click reaction）后，很多实验室开始尝试使用这个效率更高的生物正交反应对生物分子进行标记和研究。然而，由于铜离子的毒性，点击化学在细胞或活体中的使用受限很大。因此，人们开始尝试对点击化学进行无铜化改造。
在2004年开始，卡罗琳逐渐开发出了应用广泛的无铜化改进版点击化学。反应使用叠氮基团和具有很大环张力的含氟环辛炔。环张力的使用显著加快了反应的速率，使其非常接近铜催化的速率。
正是由于这些优化的化学反应的不断开发，生物正交化学在提出以后，就以无可抵挡的速度成为了对各种分子、细胞、组织、器官等进行体内和体外标记、成像以及组学分析的一种常用方法。
上世纪末和本世纪初正是糖化学和生物学发展的一个高潮期，总结自己的经历和很多其他人的研究，在2001年，卡罗琳和她在博士后时期的合作者劳拉·基斯林在《科学》发表的一篇前瞻性综述性文章，提出了 “化学糖生物学” 的概念。
化学糖生物学的内容主要包括使用合成的天然糖、糖类似物或糖复合物进行糖的性质、结构、功能、代谢、分布等的基础研究，以及利用这些分子进行新的诊断方法、抑制剂、药物和材料开发等的应用研究。从本质上看，它可以被认为是以彼得·舒尔茨（Peter G. Schultz）和斯图亚特·施莱伯（Stuart L. Schreiber）为代表的在上世纪90年代初浮现出来的化学生物学在糖研究方向上的一个投射和分枝。而在传承上，卡罗琳也正好是比彼得晚十年加入伯克利的同事，劳拉则是斯图亚特在耶鲁时的博士研究生和彼得在加州理工学院的师妹。
化学糖生物学的应用研究
卡罗琳的科研，可以简单的以2008为界，在前面的十多年里，她主要以基础研究为主，在后面的十几年里，她的研究逐渐开始向应用倾斜，这个趋势最明显的体现就是从2008年开始到现在，她成立7家从事疾病治疗和诊断研发的生物技术公司，其中5家是2015年她转到斯坦福大学后成立的，当然这些公司都是植根于卡罗琳在糖生物学方面的研究心得。
在工业界的激流勇进并没有耽误卡罗琳在学术界的成功。她在近年来一直还是糖科学领域的一位风云人物，研究成果不断地出现在世界各国的科技新闻中。在获得沃尔夫化学奖之前，她的名字上一次在新闻版面上高频率出现的时间也就离现在半年左右，也就是去年的5月份，当时她在《细胞》（Cell）杂志上发表了一个轰动性的报道，她们的研究结果指向一个惊人的发现，那就是核糖核酸（RNA）上也可能存在糖修饰。
在这篇报道之前，人们对另外两类重要的生物分子蛋白质和脂类的糖修饰已经发现了几十年了，变得非常熟悉了。人们也已经知道糖对这两类分子的修饰，是其在生命活动中通过提供能量发挥调控作用之外，对生命活动发挥调控作用的另一种重要方式。
然而，也许是因为核糖也是一种糖，对于糖和核糖核酸这一类广泛存在的生物分子的结合，一直没有什么人去特别关注过。这也就是为什么当卡罗琳等人报道了这一个惊人和有趣的发现之后，能够迅速在国际科学界引起了讨论热潮的主要原因。当然，不可否认的是，在这一意外开辟的崭新研究方向上，还有很多未解的重要谜团，比如糖的结构、连接方式、生物合成机制以及糖的作用等，这些也许还需要通过很多年大量更加深入的实验才有可能逐一揭开。
卡罗琳在2021年报道的这个发现虽然非常意外，但是她们使用的研究方法却依然是她们多年前开发，一直使用至今的一种基于叠氮基团的糖组学的研究方法。
除了喜欢使用叠氮基团进行糖生物学的研究外，卡罗琳还对连接分子（Linker）的使用情有独衷。这一科研习惯也是从研究生期间就开始了。她最近报道的一个比较有代表性的与免疫治疗相关的成果就是使用连接分子实现的。在这项研究工作中，连接分子的作用是将与抗人表皮生长因子受体2抗体（HER2抗体曲妥珠单抗）与唾液酸酶偶联在了一起。这种结构的分子的设计有利于肿瘤细胞表面过度表达的唾液酸（Sialic acid）的去除。过量的唾液酸可以在肿瘤细胞表面形成一种保护，使其免疫识别受到抑制。在曲妥珠单抗与HER2结合后，以连接分子与之相连的唾液酸酶可以选择性地从HER2＋乳腺癌细胞表面去除唾液酸，从而使免疫细胞能够通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）更有效地杀死这些肿瘤细胞。
使用类似的策略，卡罗琳最近又开始了蛋白降解新技术的开发。
在2020年发表在《自然》（Nature）杂志上的一篇文章中，她们报道了一个基于溶酶体降解途经降解蛋白的新技术，溶酶体靶向嵌合体技术（LYTAC，Lysosome-targeting chimaeras），这种新技术可以解决以前的技术中难以实现的对分泌到细胞外的蛋白和细胞膜上的蛋白进行选择降解的难题。
在这个工作中，她们巧妙地利用甘露糖-6-磷酸受体（CI-M6PR，mannose-6-phosphate receptor）和连有甘露糖-6-磷酸（M6P，mannose 6-phosphate）的特异性抗体将蛋白质转运到溶酶体进行降解。特异性抗体结合了待降解的蛋白质后，通过M6P与CI-M6PR的结合，将待降解的蛋白质带进溶酶体中。在溶酶体中，分泌蛋白和膜蛋白被靶向降解，而CI-M6PR则可以再次转运到细胞表面被循环利用。
这种生物与化学有机结合的创新性工作，正是卡罗琳研究的重心。这些研究不但可以很好地帮助揭示糖在生物学和免疫学等方面的重要作用，也可以很好地帮助实现糖在疾病诊断和治疗中的重要作用。比如HER2靶向唾液酸酶已成为她在2O15年成立的帕伦制药公司（Palleon Pharmaceuticals）管线中重要的一个，而溶酶体靶向嵌合体技术则成了她在2019年成立的利西亚疗法公司（Lycia Therapeutics）的研发平台技术。
除了这些名气比较大的研究方向外，在过去的二十多年里，卡罗琳还在另外的好几个方向上颇有建树，比如糖的硫酸化修饰、分枝杆菌糖科学方向、酶小分子抑制剂方向、纳米材料方向等，能够在这些大不相同的研究方向上自如地纵横驰骋，这与卡罗琳生物与化学交叉教育和研究背景密不可分。生物与化学的结合，也已经逐渐被证明是一种高效的糖科学研究策略。
“糖科学目前还是一个充满未知的新领域，也是一个很多研究生不愿涉足的小众领域，作为一名在这个领域探索了很多年的研究人员，我们很开心看到卡罗琳的工作能够得到沃尔夫化学奖的认可。这种认可，将会对糖科学在今后的发展起到很重要的推动作用。” 国际知名的糖科学家，美国化学会糖分会前主席，美国密歇根州立大学的黄雪飞教授评论说，“无论是在科研上还是在其它方面，卡罗琳多年来一直发挥着重要的作用。她开发的方法，极大地方便了糖的研究和应用；她引领的方向，为很多新入行的年轻科学家指明了科研道路；她的人格魅力和激情，也帮助培养和吸引了很多人进入到糖科学这个领域。”
参考文献：
1. https://wolffund.org.il/
2. https://digital.sciencehistory.org/works/3xomins
3. https://bertozzigroup.stanford.edu
4. Carolyn Bertozzi's glycorevolution, Chem. Eng. News, 2020, Volume 98, Issue 5.
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